درباره خدمت
آنالیز HPLC
آنالیز HPLC از انواع آنالیز کروماتوگرافی یکی از روش‌های متداول در شناسایی و اندازه‌گیری مولکول‌ها در نمونه‌های مختلف است. این روش به وسیله تفکیک ترکیب‌های مختلف در نمونه‌ها براساس خواص فیزیکی و شیمیایی آن‌ها صورت می‌گیرد. بعد از جداسازی ترکیب‌ها در ستون کروماتوگرافی، سیگنال‌ها به وسیله آشکارساز ارسال می‌شوند و به داده‌های الکترونیکی تبدیل می‌گردند. سپس این داده‌ها تحلیل و تفسیر می‌شوند تا اطلاعات مربوط به ترکیب‌ها استخراج گردد.ما در این مقاله از گروه آنالیز آزمایشگاهی مهراندیش قصد داریم شما را با تحلیل و تفسیر آنالیز HPLC آن آشنا کنیم پس همراهمان باشید.
برای تحلیل و تفسیر آنالیز HPLC، شما نیاز به مراحل زیر دارید:
- آماده‌سازی نمونه: نمونه‌ها باید به درستی آماده‌سازی شوند تا ترکیب‌های مورد نظر به درستی در ستون کروماتوگرافی تزریق گردند. این مرحله شامل خلوص نمونه، حلال‌سازی، فیلتر کردن و تنظیم pH ممکن است.
- تنظیم تجهیزات: تجهیزات HPLC شامل ستون کروماتوگرافی، پمپ هوازی، آشکارساز و ضابطها است. تنظیم و کالیبره کردن این تجهیزات مهم است تا دقت و قابلیت تکرار آزمایش‌ها تضمین شود.
- انتخاب محلول حلال‌گیری: حلال حل آنالیت‌ها را انتخاب می‌کند و تاثیر زمان و شدت آنالیز را تعیین می‌نماید.
- تعیین شرایط کروماتوگرافی: فشار، دما و نسبت حلال‌ها را باید بهینه کرد تا تفکیک بهتر انجام شود.
انواع HPLC
انواع مختلف HPLC به نوع فاز استاتیک (ستون)، نوع فاز موبیل (حلال‌ها)، و نوع آشکارسازها تقسیم می‌گردند. در زیر، نمونه‌هایی از انواع HPLC آورده شده است:
- HPLC فاز معکوس (Reversed-Phase HPLC):در این نوع HPLC، فاز استاتیک ستون از ماده هیدروفوبی (معکوس) تشکیل شده است که ترکیبات هیدروفیلی در این فاز جدا می‌گردند. این روش بسیار معمول در تحلیل مولکول‌های آلی مانند داروها، پپتیدها، پروتئین‌ها و مواد مضر زیستی مانند پستیسایدها استفاده می‌شود.
- HPLC فاز عادی (Normal-Phase HPLC):در این نوع HPLC، فاز استاتیک ستون از ماده هیدروفیلی تشکیل گشته است و ترکیبات هیدروفوبی در این فاز تفکیک می‌شوند. این روش در تحلیل ترکیبات گوگردی، آمین‌ها و ترکیبات آلی مورد استفاده قرار می‌گیرد.
- HPLC جذب‌نوری (Normal-Phase HPLC):این نوع HPLC بر اساس توانایی ترکیبات به جذب نور در طول موج‌های مختلف از طیف نوری (UV، مرئی و مادون قرمز) است. این روش برای شناسایی ترکیبات حساس به نور مانند آمین‌ها، کوئنون‌ها و نیتروزامین‌ها مناسب می‌باشد.
هدف از آنالیز HPLC
هدف اصلی از آنالیز HPLC (کروماتوگرافی مایع با فشار بالا)، تفکیک، شناسایی، و اندازه‌گیری ترکیب‌های مختلف در نمونه‌ها می‌باشد. این تکنیک از مزایای برتری برای تحلیل ترکیب‌های پیچیده و کم‌مقداری برخوردار است و در صنایع مختلف مورد استفاده قرار می‌گیرد.
این تکنیک اهمیت زیادی در زمینه‌های زیر دارد:
- تحلیل داروها: HPLC به‌طور گسترده در تحلیل داروها برای تعیین خلوص، کیفیت و کمیت آن‌ها به‌کار می‌رود. این روش بسیار حساس و دقیق است و برای تحلیل داروهای ترکیبی و تک‌ترکیبی مناسب است.
- تحلیل مواد غذایی: در صنایع مختلف غذایی، HPLC برای تشخیص و کمیت‌گیری اجزای مختلف مواد غذایی مانند ویتامین‌ها، آنتی‌اکسیدان‌ها، آمین‌ها و اسیدهای چرب مورد استفاده قرار می‌گیرد.
- کنترل کیفیت: HPLC به‌عنوان یک روش کنترل کیفیت مواد و محصولات در صنایع مختلف از جمله داروسازی، شیمیایی و مواد غذایی استفاده می‌شود.
- شناسایی و تحلیل ترکیبات زیستی: در علوم زیستی، از جمله بیوشیمی، بیولوژی سلولی و مولکولی، HPLC برای شناسایی و اندازه‌گیری ترکیبات زیستی نظیر پروتئین‌ها، پپتیدها، اسیدهای نوکلئیک و غیره استفاده می‌گردد.
شرایط خاص و نکات مهم آنالیز HPLC
آنالیز HPLC یک روش پیچیده و حساس است که برای تحلیل جترکیب‌های مختلف به‌کار می‌رود. در ادامه، به برخی از شرایط خاص و نکات مهمی که در اجرای آنالیز HPLC باید مدنظر قرار گیرد، اشاره می‌شود:
- حالت آشکارساز: انتخاب آشکارساز مناسب برای آنالیز مورد نظر بسیار حائز اهمیت است. آشکارسازهای متداول شامل آشکارساز UV-Vis، آشکارساز فلورسانس، آشکارساز ضربه‌ای، آشکارساز نیتروژن و آشکارساز جرمی هستند.
- فاز استاتیک ستون: انتخاب فاز مناسب ستون (مثلاً فاز معکوس یا فاز عادی) بر اساس خواص ترکیب‌های مورد بررسی ضروری است.
- فاز موبیل (حلال‌ها): نوع و ترکیب حلال‌های مورد استفاده برای جابه‌جایی ترکیبات در ستون HPLC بسیار مهم می‌باشد. ترکیب بهینه حلال‌ها باید به‌گونه‌ای انتخاب شود که تفکیک بهتری حاصل گردد و امکان دسترسی به ترکیب‌ها به‌طور کامل امکان‌پذیر باشد.
- دما: تنظیم دما در ستون HPLC می‌تواند به تحسین تفکیک ترکیبات و کاهش زمان آنالیز کمک کند. همچنین، دمای بهینه می‌تواند تغییرات طی آزمایش را کنترل نماید.
- فشار: فشار مناسب برای جریان حلال‌ها از اهمیت بالایی برخوردار است. انتخاب پارامترهای فشار به‌طور معقول می‌تواند به بهبود دقت و دقت آنالیز کمک کند.
روش‌های اندازه‌گیری کمی در آنالیز HPLC
در تحلیل و تفسیر آنالیز HPLC ، اندازه‌گیری کمی به منظور تعیین مقادیر دقیق ترکیبات موجود در نمونه‌ها انجام می‌شود. این روش‌ها به دقت و حساسیت بالایی می‌توانند کمیت‌های مختلف ترکیبات را تعیین کنند. در زیر، برخی از روش‌های اندازه‌گیری کمی در آنالیز HPLC آورده شده است:
- روش افزاینده خطی (Linear Incremental Method):این روش معمولاً برای تعیین مقادیر کمیتاتیو ترکیب‌ها استفاده می‌شود. ابتدا یک ترکیب استاندارد با غلظت معروف تهیه می‌گردد و به‌عنوان نمونه‌ی استاندارد مورد استفاده قرار می‌گیرد. سپس میزان آنالیز برای ترکیب‌های مورد نظر در چند سطح مختلف ترکیب استاندارد انجام می‌شود.
- کالیبراسیون خطی (Linear Calibration):در این روش، از یک سری از استانداردها با غلظت‌های مختلف استفاده می‌شود تا یک خط کالیبراسیون ایجاد گردد. این خط با ارتباط غلظت‌های استاندارد با مقادیر سیگنال‌های آشکارساز در نمودار کروماتوگرام حاصل می‌شود.
- روش تعیین نقطه استاندارد (Standard Addition Method):این روش مخصوصاً برای تعیین غلظت ترکیب‌هایی که در نمونه‌ها بسیار کمتر از حد تشخیص آشکارساز هستند، مفید می‌باشد. در این روش، ترکیب استاندارد به نمونه اضافه می‌شود و سپس نمونه با روش کروماتوگرافی تجزیه می‌گردد.